Biopsia liquida e screening: a un passo dalla meta?

Uno fra i principali obiettivi della ricerca oncologica è la messa a punto di test accurati per la diagnosi precoce dei tumori al fine di prevenire la diffusione metastatica. Per molte forme tumorali, infatti, sono richiesti 20-30 anni prima che avvenga la progressione verso gli stadi avanzati di malattia.  Di conseguenza, esiste un'ampia finestra temporale in cui poter identificare i tumori prima che gli stessi metastatizzino. Inoltre, anche quando il processo metastatico è iniziato ma non è evidente radiologicamente o clinicamente, la terapia sistemica ("adiuvante") può consentire la guarigione in una percentuale  che arriva fino 50% dei casi. Tuttavia, nelle forme più avanzate, la guarigione costituisce una rarità.

L'unico test ematico riconosciuto per la diagnosi precoce dei tumori è la misurazione del PSA (antigene prostatico specifico) e la validità del suo impiego è ancora dibattuta. 

Nuovi test ematici per la diagnosi dei tumori devono essere caratterizzati da una specificità elevata al fine di evitare risultati falsamente positivi generatori di controlli eccessivi, approfondimenti inutili e ansia. I test che identificano mutazioni somatiche nel sangue (“biopsia liquida”) promettono una buona specificità, essendo basati su mutazioni di geni driver caratteristiche delle cellule tumorali. Ad oggi, le mutazioni valutate mediante biopsia liquida sono state studiate quasi esclusivamente su pazienti con patologia in stadio avanzato. Inoltre, non sono stati effettuati studi su popolazioni ampie di soggetti sani, aspetto essenziale per testare la specificità.

La sensibilità è un altro aspetto rilevante in tema di biopsia liquida. L'evidenza disponibile indica che pazienti con tumori in stadio precoce possiedono < 1 molecola template con mutazione per ml di plasma, quantitivo inferiore rispetto alla capacità di rilevazione delle tecnologie disponibili che analizzano simultaneamente più mutazioni. Inoltre, la biopsia liquida ha anche il limite di non identificare la sede di orgine del tumore primitivo.

Lo studio pubblicato su Science riporta i risultati ottenuti con un nuovo test ematico chiamato CancerSEEK, che utilizza saggi combinati di alterazioni genetiche e di biomarcatori proteici con l’obiettivo di rilevare la presenza del tumore e la rispettiva sede di origine.

Inizialmente, è stato progettato un test basato sulla polymerase chain reaction (PCR) che potesse valutare simultaneamente regioni multiple di geni driver comunemente mutati in vari tipi di tumore.

Per realizzare il progetto, i ricercatori si sono confrontati con diverse sfide tecniche:

1. Il test doveva indagare un numero sufficiente di basi per consentire di evidenziare un ampio numero di tumori.
2. Ciascuna base indagata nel test doveva essere sequenziata migliaia di volte per identificare le mutazioni a bassa prevalenza.
3. Occorreva porre un limite al numero di basi indagate dal test perchè più basi si interrogano più è probabile incorrere in mutazioni artefatte che riducono il rapporto segnale/rumore.
4. Per l’implementazione in un setting di screening, il test doveva essere costo-efficace.

Al fine di trovare delle soluzioni relative ai punti sopracitati, è stato ricercato il numero minimo di brevi ampliconi che potessero permettere di evidenziare almeno una mutazione di un gene driver per ciascuno degli 8 tumori studiati.

Utilizzando i dati di sequenze disponibili pubblicamente, è stata trovata una relazione tra il numero di ampliconi richiesti e la sensibilità diagnostica, con un plateau a ~ 60 ampliconi. Una volta raggiunto il plateau, all'aumentare il numero di ampliconi non aumentava la capacità diagnostica ma si generava una maggiore probabilità di risultati falsamente positivi.

Sulla base di tali dati, è stato disegnato un pannello di 61 ampliconi, con ciascun amplicone indagante in media 33 coppie di basi nell’ambito di 16 geni. Su base teorica, il panello avrebbe evidenziato dal 41% (fegato) al 95% (pancreas) dei carcinomi presenti nel dataset COSMIC “Catalog of Somatic Mutations in Cancer (COSMIC). In pratica, il pannello ha prodotto risultati molto migliori, evidenziando almeno una mutazione nell’82%, due mutazioni nel 47%, e >2 mutazioni nell’8% degli 805 carcinomi analizzati.

La migliore performance è dipesa dal saggio di sequenziamento testato “PCR-based”, più sensibile nell’identificare le mutazioni rispetto al convenzionale “genome-wide sequencing”.

La capacità diagnostica del DNA tumorale circolante (ctDNA) è risultata diversa in base al tipo tumorale, andando dal 60% per l’epatocarcinoma al 100% per i carcinomi ovarici.
Grazie a questo pannello di ampliconi, sono stati sviluppati due approcci che hanno consentito la diagnosi di mutazioni rare la cui presenza è attesa nel ctDNA plasmatico. In primis, è stata utilizzata una multiplex-PCR per marcare in modo diretto e univoco ciascuna molecola template originale con DNA barcode.
In aggiunta, il CancerSEEK è stato basato sull’analisi di biomarcatori proteici. Un’analisi della letteratura è stata effettuata per identificare proteine associate alla presenza di almeno uno degli 8 tipi tumorali con sensibilità > 10% e specificità >99%.
Sono stati identificati 41 biomarcatori proteici potenziali, analizzati preliminarmente su campioni plasmatici di soggetti sani e con tumore. È stato osservato che 39 di queste proteine potevano essere valutate in modo riproducibile attraverso una singola piattaforma di immunoassay. Successivamente, 8 proteine su 39 si sono rivelate particolarmente utili nel discriminare tra soggetti sani (controlli) e soggetti con diagnosi di tumore.

Popolazioni in studio:

• Il test CancerSEEK è stato quindi applicato a 1005 pazienti con diagnosi di tumore in stadio I-III delle seguenti sedi: ovaio, fegato, stomaco, pancreas, esofago, colon-retto, polmone, mammella. Nessun paziente aveva ricevuto chemioterapia neoadiuvante precedente alla raccolta del campione ematico e in nessuno caso vi era evidenza di metastasi a distanza.Età mediana alla diagnosi: 64 anni (range 22 to 93). Stadio alla presentazione: I (20%), II (49%), III (31%).
• Coorte di controllo: 812 soggetti sani di età mediana 55 anni (range 17 to 88) senza storia nota di carcinoma, displasia di alto grado, malattia autoimmune, malattia renale cronica.

Core metodologico:

CancerSEEK valuta i livelli di 8 proteine e la presenza di mutazioni in 2001 posizioni del genoma; ciascuna posizione genomica potrebbe essere mutata in diversi modi (sostituzione di singola base, inserzioni, delezioni). La presenza di una mutazione in uno dei geni driver valutati o l’elevazione nel livello di una qualsiasi delle 8 proteine indicherebbe il risultato come positivo. Le sensibilità e le specificità medie del test sono state determinate mediante 10 iterazioni di cross-validazione ripetute 10 volte. Le curve ROC per l’intera coorte di pazienti e di controlli hanno portato a una sensibilità mediana del test pari al 70% per gli 8 tipi tumorali, e sono andate dal 98% nei carcinomi ovarici al 33% nei carcinomi mammari. A questa sensibilità, è corrisposta una specificità > 99%; in altri termini, il test è risultato positivo in soli 7 su 812 soggetti sani. Sebbene non si potesse avere la certezza assoluta che i controlli non avessero un tumore sottostante, i 7 casi sono stati classificati come “falsi positivi” per mantenere l’approccio più conservativo possibile nella classificazione e interpretazione dei dati.
Le caratteristiche del test più important per l’algoritmo sono state la presenza di mutazione nel ctDNA e, a seguire, un incremento dei livelli di CA-125, CEA, Ca 19-9, prolattina (PRL), hepatocyte growth factor (HGF), osteopontina (OPN), mieloperossidasi (MPO), e tissue inhibitor of metalloproteinases 1 (TIMP-1).