A lezione di biopsia liquida per lo studio del carcinoma mammario

Le analisi su BL e su BT hanno identificato una simile prevalenza di varianti corte (mutazioni puntiformi e indel corte) nella maggioranza dei geni. 

Entrambe le piattaforme hanno rilevato una frequenza rappresentativa di alterazioni attivanti nel gene PIK3CA corrispondenti alle varianti predittive del beneficio da alpelisib (27.5% su tessuto e biopsia liquida). Inoltre, nel 4.5% delle analisi su BT e nel 7.2% delle analisi su BL sono emerse 2 o più mutazioni di PIK3CA, verosimilmente indicative di sensibilità agli inibitori di PI3K.

Alterazioni deleterie di BRCA1/2 sono state osservate con frequenza simile nelle due piattaforme (7.1% su BT e 7.4% su BL). 

Da notare la più alta prevalenza su BL vs BT di alcune mutazioni associate a resistenza terapeutica: ESR1 (25.9% vs 10.6%), NF1 (8.1% vs 4.5%), KRAS (4.1% vs 2.0%), RB1 (8.0% vs 4.6%) HER2 (4.3% vs 3.4%).

Un confronto di mutazioni puntiformi e indel nei diversi sottogruppi ha mostrato una sostanziale somiglianza nei pattern di alterazione genica tra le due piattaforme (BT vs BL), con differenze significative legate all’alta prevalenza di alterazioni di ESR1 e FGFR1 su BL di tumori ER+, e di PTEN su BL di carcinomi mammari triplo negativi.

Complessivamente, la BL ha mostrato una minore sensibilità per alterazioni quali copy number variations riguardanti MYC, FGFR2, e amplificazioni di HER2.

Non sono emerse sostanziali differenze tra le piattaforme nell’identificazione di alterazioni concomitanti (es., TP53 con BRCA1 o PIK3CA con ESR1). 

Su un totale di 6757 pazienti con profilazione su BT e di 1150 pazienti con profilazione su BL, e per i quali erano disponibili informazioni cliniche, sono emerse differenze riguardo ad alcune caratteristiche associate all’utilizzo delle piattaforme. In particolare, rispetto alla BT, la BL è stata utilizzata maggiormente per la profilazione in pazienti con età più avanzata (63 anni vs 60 anni), con malattia metastatica (86.7% vs 74.3%) e maggiormente pretrattate (mediana 3+ vs 2), a suggerire che la BL è stata usata più frequentemente nel setting avanzato. 

Un totale di 712 pazienti ha ricevuto una profilazione su BL dopo averla fatta su BT. I campioni sono risultati eterogenei temporalmente, con una mediana di 495 giorni (range 0–6455 giorni) tra le diverse acquisizioni. Riguardo alle mutazioni a significato patogenico rilevate su BT, la percentuale di accordo positivo (PAP) con la BL è stata del 72%, largamente influenzata dalla frazione tumorale stimata e dalla probabilità di stato germinale. La PAP più alta è stata osservata in campioni con una frazione tumorale >10%, specie in presenza di mutazioni azionabili quali quelle di PIK3CA (93%) e di BRCA1/2 (95%). 

In caso di alterazioni verosimilmente germinali, la PAP è stata del 100% vs il 70% in caso di alterazioni verosimilmente somatiche. Come prevedibile, le alterazioni germinali sono state identificate indipendentemente dalla frazione tumorale, essendo intercettabili anche su DNA non tumorale. 

Le BT sono state analizzate anche in base al sito: locale (biopsia mammaria), metastatico (biopsia di una sede a distanza) e regionale (biopsia linfonodale). In ragione di un maggiore shedding di ctDNA, la PAP è risultata più elevata nei campioni da biopsia di sede metastatica e linfonodale rispetto a quelli di biopsie mammarie (80% vs 78% vs 58%). Non è stata osservata alcuna differenza nella PAP in base al sottotipo di tumore o al tempo intercorso tra le analisi. 

Il panorama delle mutazioni acquisite nel follow-up e documentate mediante BL ha evidenziato la seguente frequenza di mutazioni, dalla più comune alla meno comune: TP53 (246 alterazioni; il 26.8% delle acquisite), ESR1 (181; 19.7%), NF1 (69; 7.5%), PIK3CA (65; 7.1%), BRCA2 (48; 5.2%), PTEN (39; 4.2%), RB1 (32; 3.5%), HER2 (21; 2.3%).

Inoltre, è stata osservata una lunga coda di mutazioni meno frequenti con varianti corte acquisite viste in 48 geni, fra cui KRAS (n = 13), AKT1 (n=9), EGFR (n= 7), FGFR2 (n =7), BRAF (n= 5), MTOR (n=4), FGFR1 (n=4), NRAS (n= 3), HRAS (n= 2), FGFR3 (n = 1), RET (n= 1). 

Le varianti corte acquisite sono risultate più frequenti in pazienti con un intervallo più lungo tra le biopsie (in particolare, BL effettuate a distanza di ≥3 anni avevano acquisito una alterazione nel 69.5% dei casi). 

Inoltre, le alterazioni acquisite sono risultate più frequenti nei campioni del sottotipo ER+/HER2− (60%) e meno frequenti in campioni di carcinoma mammario triplo negativo (51%) ed HER2+ (51% se ER+/HER2+, 33% se ER−/HER2+).

Sebbene meno comuni, le BL hanno intercettato anche amplificazioni o riarrangiamenti acquisiti (n = 77): amplificazioni ricorrenti in FGFR1 (n=9), CD274 (PD-L1; n= 5), PDCD1LG2 (PD-L2; n=4), MYC (n =3), RET (n=3), EGFR (n=2), ERBB2 (n =2), ESR1 (n=2), KRAS (n =2) e PIK3CA (n = 2); riarrangiamenti di NF1 (n= 5), BRCA1 (n=4), BRCA2 (n=4), TP53 (n=4), RB1 (n =3), CDK12 (n= 2), FGFR2 (n = 2), PTEN (n =2).

Molte delle alterazioni acquisite sono corrisposte a potenziali target. Sebbene le mutazioni acquisite di PIK3CA sono state riscontrate meno frequentemente nei codoni canonici 542/545/1047 (35/65, 54% acquisite vs 134/184, 73% delle condivise tra BL e BT; p = 0.008) e hanno incluso mutazioni di E726K (9/65), E418K (3/65), E53K (3/65), la maggior parte di esse sono comunque potenziali target di inibitori di PI3K.

Nel sottotipo ER+/HER2−, le alterazioni di PIK3CA sono state osservate nell’8% delle pazienti. Report precedenti avevano associato le mutazioni di PIK3CA con i processi mutagenici APOBEC e, in analogia, nello studio il 77% (48/62) delle alterazioni missenso di PIK3CA sono state osservate in tale contesto. 

Le varianti corte di HER2, potenziali target di TKIs anti-HER2 o di ADC anti-HER2 sono state riscontrate sia nel sottotipo ER+/HER2− che in quello HER2+ (2% e 4%, rispettivamente). In entrambi i casi, possono rappresentare un meccanismo di resistenza (endocrinoresistenza o resistenza agli agenti anti-HER2). 

Tra le varianti rare intercettate dalla BL, alterazioni in membri della famiglia FGFR1-3 sono state osservate nel 3% (23/712) dei casi, prevalentemente nella malattia ER+. Fra queste, amplificazioni di FGFR1 (n = 9 casi) e fusioni FGFR1/2 (n = 3 casi). 

Nel follow-up, alcuni pazienti hanno sperimentato eventi subclonali multipli di reversione di BRCA1/2.

Quindi, la BL risulta utile nell’identificare eventi subclonali presenti solo in una porzione del tumore o della metastasi.  Inoltre, le alterazioni acquisite tendono ad essere policlonali, con differenze tra i diversi sottotipi. Ad esempio, >50% dei campioni con alterazioni di PIK3CA e TP53 mostrano ≥2 alterazioni.  Similmente, alterazioni policlonali sono osservate in BRCA1, ESR1, ERBB2, BRCA2. D’altro canto, alterazioni in KRAS e CDH1 spesso riguardano singoli eventi. Nell’intera coorte della BL, le mutazioni policlonali sono frequenti e riguardano soprattutto ESR1, TP53, PIK3CA e NF1 (~20%+), mentre altre alterazioni, quali quelle in AKT1, KRAS, EGFR sono comunemente monoclonali.  La presenza delle più comuni alterazioni policlonali allude alla convergenza evolutiva di più meccanismi coinvolti nella resistenza acquisita. 

Lo studio ha quindi esaminato l’associazione tra alterazioni acquisite e pattern di trattamento in 196 pazienti con test genomici longitudinali. In linea con quanto osservato nella coorte complessiva, le alterazioni più frequenti sono state osservate a carico di: TP53 (30.1%), ESR1 (20.3%), PTEN (15.4%), NF1 (12.6%), PIK3CA (10.5%), ATM (3.5%), BRCA1 (4.2%), RB1 (3.5%), KRAS (2.8%), HER2 (2.1%), BRCA2 (2.1%).

Nello specifico, una maggiore frequenza di alterazioni di ESR1 e di RB1 è stata osservata in pazienti trattate con terapia endocrina e inibitori di CDK4/6, e una maggiore frequenza di reversioni di BRCA1/2 in pazienti trattate con inibitori di PARP.